1. Введение: ТЕОРИЯ НАКОПЛЕНИЯ ИЗМЕНЁННЫХ БЕЛКОВ И НАРУШЕНИЕ ПРОТЕОЛИЗА ПРИ СТАРЕНИИ.

Протеолиз - это процесс расщепления белков и пептидов в организме с участием специальных ферментов. Одна из важнейших ролей протеолиза состоит в том, что он приводит к необратимой инактивации белков и, таким образом, участвует в кругообороте белков в клетке. Существует множество ферментов, осуществляющих протеолиз - это разнообразные протеазы (лизосомные, митохондриальные, кальций-зависимые и др.), а так же сложные белковые комплексы, "протеасомы". У эукариот протеасомы присутствуют в цитозоле и ядрах.

Протеасомы выделяют в виде индивидуальных частиц с коэффициентами седиментации 20S и 26S. 20S частица является коровой частью 26S частицы, которая обладает протеолитической активностью. Коровая частица представляет собой белковый комплекс в виде цилиндра, через центральный канал которого "протягивается" молекула гидролизуемого белка. Судя по рентгеноструктурным данным, 20S протеасома представляет собой полый цилиндр, образованный четырьмя лежащими друг на друге кольцами. Каждое из них состоит из семи белковых субъединиц, причем периферические кольца сформированы субъединицами alpha-типа, а два центральных — beta-типа: Существуют свидетельства, что накопление повреждённых белков действительно происходит с возрастом и может отвечать за такие ассоциированные с возрастом болезни как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и катаракта. Механизмы накопления таких белков могут быть различны. Например, формирование окисленных белков является типичным результатом влияния активных форм кислорода, которые образуются в результате многих метаболических процессов клетки и часто препятствуют корректной работе белка. При этом механизмы репарации не всегда могут распознать повреждённые белки и становятся менее эффективными с возрастом, в том числе за счёт снижения активности протеасом. В некоторых случаях белки являются частью статических структур,(например, клеточной стенки), которые не могут быть легко разрушены. Кругооборот белков зависит также и от белков-шаперонов, которые помогают белкам принимать необходимую конформацию. С возрастом наблюдается снижение репарирующей активности, хотя это снижение может быть результатом перегрузки шаперонов (и протеасомы) повреждёнными белками.

2. "АНТИВОЗРАСТНЫЕ" СТРАТЕГИИ ИССЛЕДОВАТЕЛЕЙ, СВЯЗАННЫЕ С ПРОТЕОЛИЗОМ:

Принципиальные воздействия на функциональную активность протеасом могут осуществляться на нескольких уровнях (Chondrogianni and Gonos, 2005):

На уровне экспрессии белков субъединиц, входящих в состав протеасом (A);

На уровне сборки субъединиц в готовую к выполнению своих функций протеасому (B);

На уровне регуляции ферментативной активности как самой протеасомы, так и ее белков-регуляторов (C, D);

На уровне белков-ингибиторов протеасом, накапливающихся с возрастом (E).

3. Доктор Эстафиос Гонос показал, что стимуляция эспрессии субъединиц протеосомного комплекса увличивает уровень его сборки и продолжительноть жизни клеток

Место работы: Институт биологических исследований и биотехнологий (Institute of Biological Research and Biotechnology), Греция.

Основное направление исследований: Работа группы посвящена молекулярной генетики старения человека. В лаборатории была разработана бессмертная клеточная линия фибробластов, полученная из эмбрионов крыс. Клеточная линия начинает проявлять признаки старения при инактивации Т-антигеном вируса SV40. Благодаря этому были клонированы несколько ассоциированных генов старения. Исследования показали особо важную роль одного из них - гена, кодирующего кластерин (аполипопротеин J). Также в лаборатории исследуется роль протеасом при репликативном старении. Исследователи показали, что у долгожителей сохраняется с возрастом уровень функционирующих протеасом. В настоящее время они занимаются разработкой способов увеличения продолжительности жизни клеточных линий за счет активации экспрессии субединиц протеасомного комплекса.

Основные последние исследования лаборатории в области активации протеасом: Исследователей вдохновила работы Голдберга и соавторов 1994 и 1996 г. (Gaczynska et al., 1994, Gaczynska et al., 1996), в которых впервые было показано увеличение активности протеасом в клетках линии HeLa при их трансфекции геном beta-5i субъединицы протеосомы, а также при оверэкспрессии генов beta-1i и beta-1 субъединиц. В лаборатории Гоноса осуществляли оверэкспрессию субъединицы beta-5 в клетках линии WI38/T и HL60 (Chondrogianni et al., 2005). Оказалось, что при этом уровни экспрессии других субъединиц также возрастали. Кроме того, возрастал уровень сборки субъдинц в протеосомный комплекс, уровень активности протеасом. Такие клетки были более устойчивы к воздействиям различных оксидантов. Важно отметить, что оверэкспрессия субъединицы beta-5 в клеточной линии фибробластов IMR90 увеличивала продолжительность ее жизни на 15-20%, также это уменьшало уровень различных биомаркеров старния. Такие же результаты были получены на эпителиальных клетках хрусталика человека (Liu et al., 2007) и мышиных клетках нейробластомы (Kwak et al., 2007).

Недавно в лаборатории Гоноса показали на линии фибробластов эмбрионов человека WI38/T, что возрастание уровня сборки и функциональной активности протеасом можно добиться оверэкспрессией hUMP1/POMP белка (Chondrogianni and Gonos, 2007). Как известно, данный белок участвует в сборке протеосомного комплекса. Стимуляция его экспрессии также приводила к увеличению устойчивости клеточной линии к различным оксидантам.

В настоящее время в лаборатории Гоноса ведутся исследования с целью поиска других регуляторных факторов, участвующих в сборке хромосом, на уровень которых можно было бы воздействовать. Перспективным считается недавно обнаруженная группа шаперонов PAC1-3 и белок, взаимодействующий с протеасомной АТФазой PAAF1 (proteasomal ATPase-associated factor 1) - негативный регулятор ее протеасомной активности (Chondrogianni and Gonos, 2008).

4. 2. Профессор Бертран Фригет показал, что регуляцией уровня экспрессии протеасомных субъедниц, а также обработкой клеток экстрактом водоросли Phaeodactylum tricornutum можно препятствовать старению кожи чловека.

Место работы: Лаборатория биохимии и клеточной биологии старения, Парижский Университет (Université Paris), Франция.

Основное направление исследований: Лаборатория в настоящее время изучает участие систем, осуществляющих модификации и функциональную поддержку белков в клетке в процессе старения. Группой было показано, что возрастные изменения структуры белков (появление окисленных, гликозилированных, убиквитиллированных белков при старении клеточных линий кератиноцитов человека, фибробластов, моноцитов, миоцитов и др.) сопровождается снижением уровня и активности 20S частицы протеасомы. Те же симтомы наблюдаются при облучении клеток ультрафиолетом, обработке токсичными веществами, оксидантами. Молекулярные механизмы данных процессов являются предметом активного изучения лаборатории Фригета.

Последние исследования лаборатории в области участия протеасом в развитии реакции клетки на окислительный стресс: Предполагают, что накопление окисленных белков при старении связано с нарушениями протеасомной деградации. Известно, что облучение ультрафиолетом фибробластов кожи человека запускает в них сигнальный каскад, приводящий к повышенной экспрессии металлопептидазы 1 матрицы (MMP-1), которая вызывает разрушение внеклеточных белков (в том числе, коллагена), приводящее к старению кожи:

Группой Фригета было показано, что эти процессы сопровождались накоплением c-Jun и активацией AP-1 - транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию металлопептидазы. Такие же процессы наблюдались при ингибировании протеасом белками, вызывающими формирование поперечных сшивок и лактацистином. Это говорит о том, что механизмы у данных процессов общие. В свою очередь, оверэкспрессия субъединиц протеасом приводила к тому, что в ответ на облучение уровень металлопептидазы не повышался (Catalgol et al., 2009). Перспективность данных исследований состоит в том, что, по видимому, воздействуя на активность протеасом можно регулировать интенсивность старения кожи человека. В настоящее время данные закономерности требуют более подробного исследования.

Кроме того, в лаборатории Фригета обнаружили (Bulteau et al., 2006), что экстракт водоросли Phaeodactylum tricornutum способен защитить проеасомы кератиноцитов человека от вредного воздействия ультрафиолетового излучения. Как известно, ультрафиолетовое излучение индуцирует накопление активных форм кислорода в клетках кожи (синглетного кислорода, супероксид-аниона, гидроксильного радикала и пр.). Эти соединения взаимодействуют с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами и индуцируют их молекулярные изменения, например, формирование поперечных сшивок, карбоксилированных белков и пр. Ранее в лаборатории было показано, что при облучении ультрафиолетом человеческих кератиноцитов уровень окисленных белков в их цитозоли повышался, а уровень протеолитической активности протеасом, напротив, понижался (Bulteau et al., 2000). Интересно, что похожие процессы происходят в коже в процессе старения. Более того, молекулярные механизмы данных процессов отчасти общие (Petropoulos et al., 2000).

В лаборатории Фригета поставили целю исследовать, могут ли экстракты различных растений каким-либо образом препятствовать трансформации белков при облучении, ведь в таком случае эти препараты в перспективе можно было бы использовать для замедления старения кожи. Исследования показали, что экстракт водоросли Phaeodactylum tricornutum способен активировать протеолитическую активность протеасом. Даже при облучении у обработанных экстрактом водоросли клеток уровень активных протеасом был практически таким же, как у необлученных клеток и значительно выше, чем у контрольной группы. Более того, уровень окисленных белков при обработке экстрактом и последующим облучением был значительно ниже, чем у необработанных.

Извесно, что в апоптотических сигнальных каскадах, происходщих при облучении клеток, принимают участие белки, регулирующие активность протеасом. Дальнейшие исследования эффектов экстракта Phaeodactylum tricornutum - подающее надежды направление в области повышения жизнеспособности кератиноцитов кожи при воздействии солнечной радиации.

5. 3. Профессор Мария Перейра показала, что у молодых и у старых особей Drosophila melanogaster различаются основные формы протеосомных субъединиц

Место работы: кафедра биологии старения, Хантерский Колледж Нью-Йоркского Университета (Hunter College of City University of New York), США.

Основное направление исследований:

При многих нейродегенеративных заболеваниях (в их числе болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.) выявлены сенильные бляшки, различные тела включения и дегенеративные волокна, обогащенные убиквитином. Известно, что подлежащие "утилизацации" белки снабжаются особыми химическими метками, содержащими белок убиквитин. Убиквитин обеспечивает присоединение разлагаемого белка к протеасоме, а непосредственно перед началом разложения отрывается для повторного использования:

Лаборатория в настоящее время изучает роль убиквитин-протеасомного сигнального пути в развитии таких старческих нейродегенеративных заболеваний как болезнь Альцгеймера, Паркисонизм и др. В частности, исследуется, какую роль протеасомы играют в процессах нейродегенерации, клеточной смерти (Vernace et al., 2007). Для этого совместно с группой профессора Томаса Шмидт-Гленевинкеля в лабратории разрабатывается трансгенная модель Drosophila melanogaster, экспрессирующая генетические дефекты протеасомной активности. Эту модель планируется использовать для исследования молекулярных механизмов клеточной смерти вследствие нарушения функциональной активности протеасом.

Последние исследования лаборатории в области роли нарушений активности протеасом при развитии старческих нейродегенеративных заболеваний: Группа Марии Пейрера исследовала нарушение убиквитин-протеасомного пути на модели старения Drosophila melanogaster. Оказалось, что у старых особей (43-47 дней) основной формой протеасом является менее активная 20S, в то время как у молодых особей (1-32 дней) - 26S. Параллельно показано, что у старых особей снижался общий уровень АТФ более ем на 50%, в то время как сборка 26S протеасомы является АТФ-зависимой. Это также подтверждает снижение двигательной активности у старых особей.

Кроме этого, воздействие ингибитором протеасом PSI на молодых мух не влияло на продолжительность их жизни, в отличие от старых.

Эта работа показывает, что нарушение белкового оборота и накопление ошибочных белков, которое наблюдается в старости, обусловлено, в частности, снижением уровня сборки 26S протеасомы. Важную роль в этих процессах играет понижение уровня АТФ в клетке. Генетические механизмы, являющиеся причиной данных событий - предмет дальнейших планируемых исследований.

Следующая страница: 1 2